试管婴儿过程中涉及到的三代技术有哪些？

关于试管婴儿过程中涉及到的三代技术——PGT的起源，追溯于50多年前Edwards提出关于PGT的设想，并利用荧光显微镜从受精后5d的兔囊胚中取出少量滋养外胚层细胞进行活检，通过分析X-染色质区分胚胎性别。1978年，世界首例“试管婴儿”LouiseBrown的诞生，使PGT应用于人类成为了可能。受政治、宗教等社会因素以及PGT自身误诊风险的影响，PGT技术在很多国家和地区并不被法律所认可。直至1990年，Handyside团队首次对携带不同X-连锁隐性遗传病基因的两对夫妇，进行了卵裂球阶段的单细胞活检，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增Y染色体特异DNA重复序列，筛选合适的胚胎性别并种植后顺利妊娠，1990年世界上首例经PGT的健康婴儿诞生标志其正式登上历史舞台。2年后，通过巢式PCR技术，Handyside团队成功对第7号染色体上突变的致病CFTR基因进行PGT-M检测，双方均携带有纤维囊性化致病基因变异的夫妇拥有了健康孩子。

在基因组学、分子生物学、分子遗传学等多种新技术产生与成熟的基础上，PGT在20世纪90年代进入快速发展期。现如今，已有成千上万的孩子通过PGT健康地来到这个世界，其中超过2/3是通过PGT-A检测排除非整倍体的风险，1/3通过PGT-M与PGT-SR排除相关遗传性疾病。作为辅助生殖技术的主要进步之一，PGT现广泛应用于临床，离不开近30年来胚胎活检、胚胎冻存以及遗传学检测技术的不断创新与突破。

PGT活检技术

获得可用于检测的胚胎遗传物质是进行PGT的基础。根据患者的不同情况，可选择不同阶段的PGT活检方法，目前主要包括极体、卵裂球与囊胚活检。

极体活检适用于未受精的卵母细胞或受精卵，可在最早期检测出相关母源性致病基因或染色体异常，最突出的短板在于无法检测父方的遗传缺陷。若出现染色体交叉互换，第一极体可能会同时携带正常与突变基因，这种情况下需进一步检测第二极体，才能较准确地间接推断卵母细胞遗传信息。

卵裂球活检指在受精后3d的6～8细胞的卵裂球阶段获取1～2个细胞进行活检，应用较为广泛，主要局限性在于取材少，对胚胎损伤相对较大，移植率、妊娠率均降低，陆续也有实验证实2-细胞活检相比于单细胞活检，可降低约40%活产率。另外，卵裂球期嵌合体发生率可达30%甚至更高，因嵌合胚胎种植率低、流产率高，既往不建议移植，但2015年Greco等在NEJM首次报道嵌合胚胎成功妊娠，认为其中约1/3可发育为健康子代，对于卵巢功能低下的患者而言，放弃嵌合胚胎可能造成较大的损失。

发育至5～6d的囊胚约含120个细胞，从其中抽取5～10个滋养外胚层细胞（TE）进行活检，称为囊胚活检。优势在于取材量较充足，检测结果更可靠，对发育成胎儿部分的内胚层细胞团（ICM）无损害，更加安全，且一部分染色体异常的胚胎细胞可进行自我淘汰，囊胚嵌合体发生率约为10%，妊娠率也相应提高，成为越来越多患者的选择。

近年，对囊胚腔液（BF）及培养液中游离DNA的关注度日益增加，但目前很多研究显示BF或培养液中游离DNA与TE的检测结果常不一致，推测与胚胎可能存在的自我修正机制，以及样本量过少、外源性DNA污染等因素相关。所以，寻找一种可靠的生物标志物是进行非侵入性PGT的关键挑战之一。

胚胎玻璃化冻存技术

在胚胎冻存技术问世以前，被活检之后的胚胎均需在受精后第6天前移植入同步化的子宫，所有遗传检测结果要在此之前完成，繁重的工作量限制了PGT临床推广。2018年我国一项多中心随机对照试验表明，冻胚移植移植率、妊娠率、活产率与鲜胚移植无明显差异，并可有效降低卵巢过度刺激综合征风险。

除冻存胚胎外，玻璃化冻存技术还可广泛应用于保存干细胞、卵母细胞、卵巢、工程化组织等，大力推动了生育力的保存、组织工程治疗等领域的研究进展。人类成功妊娠第一枚经慢速程序化冷冻（SF）的胚胎报道于20世纪80年代，目前慢速程序化冷冻和玻璃化冻存在临床上均有使用。SF使用的冷冻保护剂（CPA）浓度相对较低，缓慢降温过程中仍难以避免冰晶的形成，对细胞各结构及组织造成不同程度的损伤，且对降温速率的精准程度有严苛的要求。减少这些损伤的关键在于提高冷冻速率与复温速率，具有超高降温速率的玻璃化冷冻技术应运而生，可显著减少冷冻过程中冰晶形成。为克服玻璃化所需高浓度CPA带来的细胞毒性等问题，研究人员发明了不同的载体如电子显微镜铜网、Cry⁃oloop、Cryoto等，通过减小样本体积提高冷却速率。已有不少研究表明，经玻璃化冷冻的胚胎复苏率、种植率、妊娠率均高于慢冻法，样本类型、体积大小，CPA浓度、夫妻双方年龄等多种因素均可影响胚胎玻璃化冻存效果，冻胚移植的安全性以及复苏胚胎选择的优先级次序等诸多疑问尚无明确定论，仍需进一步的研究确定更为规范、安全、高效的胚胎冻存、复苏、移植程序。

PGT遗传物质检测技术

面对与日俱增的临床需求，PGT核心检测技术的不断进步是其临床转化的关键。PGT检测技术总体上可分为基于核酸杂交的间接检测与核酸序列的直接测定，前者通过已知基因序列的探针对目标序列进行捕获检测，如ASO反向斑点杂交、荧光原位杂交（FISH）等，后者是直接获得核酸序列信息的唯一手段，如第一代Sanger测序、第二代焦磷酸及高通量测序。1983年KaryMullis发明了轰动世界的PCR技术，实现了DNA片段快速大量的扩增，极大地提高了产前诊断的效率。最早的单细胞PCR技术在1990年首次应用于X-连锁肾上腺脑白质营养不良和X-连锁精神发育迟滞的胚胎植入前诊断，标志着PCR成为PGT-M重要的检测方法之一。PGT-A领域则有同为经典的FISH技术，现可用于快速检测诸多可能与染色体微缺失/微重复相关的出生缺陷疾病，如Prader-Willi综合征、Angelman综合征等等。

目前临床上常用的PGT单细胞遗传物质检测方法主要包括PCR、FISH、微阵列技术以及下一代测序技术。2004年，全基因组扩增（WGA）技术的发明克服了单细胞水平基因检测DNA模板量过少的问题，极大地提高了检测结果的准确性以及单细胞分析的可靠度，主要包括简并寡核苷酸引物PCR技术（DOPPCR）、多重置换扩增（MDA）以及目前较为看好的单细胞全基因组扩增方法——多次退火环状循环扩增技术（MALBAC），MALBAC可将样本起始量降至皮克级，有较高的扩增均一性和基因组覆盖率，可在一定程度上降低等位基因脱扣率。

PGT-M的实施不仅依赖于DNA扩增技术的提高，还得益于DNA标记技术取得的长足进步。20世纪70年代末，Kan等学者利用最早第一代DNA标记技术RFLP对羊水穿刺获得的胎儿细胞DNA进行间接基因诊断，判断其是否带有镰刀细胞贫血症致病基因，这也是最早的产前诊断。第二代DNA标记技术为具高度多态性的短串联重复序列（STR），2006年Renwick等在利用MDA成功扩增49枚囊胚DNA的基础上，结合使用STRs连锁分析，开发出只需一组标志物可检测同种单基因疾病不同携带者的快捷高效检测方法，无需对特定突变进行个体化测试，并首次提出“胚胎植入前单体型分析（PGH）”体系，并完成了杜氏肌营养不良与囊性纤维化病变的基因检测。但STR在人类基因组中数量有限，分布不均匀，进行基于家系的靶向单体型分析时需对每个病例进行个体化设计，导致检测周期延长，效率较为低下，一定程度上限制了其在临床的广泛应用。单核苷酸多态性（SNP）的应用意味着第三代多态性标记时代的到来，SNP指由于单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，是拥有数目最多、分布最广的遗传标记，与微阵列基因芯片技术相结合，形成单核苷酸多态性微阵（SNParray），与微阵列比较基因组杂交技术（aCGH）并驾齐驱，将PGT诊断精确度推上新的高度。

众所周知，单细胞基因分析过程中无法回避的主要问题为等位基因脱扣（ADO），即等位基因其中之一优势扩增，甚至另一个扩增完全失败，造成单核苷酸变异检测结果的假阳性或假阴性，是造成PGT-M误诊、可移植胚胎数目减少的重要因素之一，发生率可达10%左右。为尽量减少ADO、样本污染等因素的影响，现临床上常规推荐同时进行突变位点的直接检测与遗传多态位点（SNP/STR）连锁分析。近年来，基于SNP芯片的核型定位（karyomapping）技术逐渐兴起，可同时连锁分析父母和先证者（或已知疾病状态的参考个体）全基因组近30万个SNP位点，检测大量单基因疾病如马凡综合征、囊性纤维化等。Karyomapping可避免ADO的发生，检测成功率可高达95%。当SNP探针足够多时，Karyomapping还可识别一部分染色体的异常，包括减数分裂起源的多倍体、单亲二倍体或部分缺失，甚至染色体易位、重排等变化，为建立可同时检测单基因疾病及染色体异常的通用PGT体系提供了解决思路。

1977年Sanger等以噬菌体为研究对象完成了世界上首次基因组测序，第一代Sanger测序法诞生，基因组学时代就此拉开序幕。单细胞WGA相关技术不断进步，推动着测序技术的更新换代，高通量测序技术（HTS）走进人们的视野，给PGT技术带来了革命性的改变。HTS也被称为下一代测序技术或二代测序（NGS）技术，通过DNA文库制备、高通量测序、遗传检测数据的分析与解读，实现了一次性对上百万条DNA进行测序，不仅缩短了耗费时间，也将单碱基测序成本降至了最低，遗传性疾病的诊断率和分辨率迈入新的高度。

以NGS为基础的主要技术包括全外显子组测序、目标区域重测序、全基因组重测序。全外显子组虽仅占全基因组的1%左右，但约有85%的疾病相关突变点位于外显子编码区，加之全基因组测序价格较为昂贵，因此基于NGS的全外显子组测序在临床应用更为广泛。2013年，Treff等对携带常染色体隐性疾病（Walker-Warburg综合征、囊性纤维化、家族性自律神经失调、X连锁低磷性佝偻病、神经纤维瘤）致病性变异的6对夫妇胚胎，进行囊胚活检、全基因组扩增及高通量测序，最终显示与qPCR为基础的检测结果完全一致。NGS与MALBAC技术相结合，建立了等位基因映射识别胚胎平衡易位携带状态技术（MaReCs），以区分染色体平衡结果携带者，阻断易位染色体向子代传递。

如前文所述，虽核型定位可同时用于检测非整倍体与单基因突变，但实际操作上对于染色体拷贝数变异的检测仍存在分辨率不足，并且无法直接获得突变位点的相关信息。为突破这些难点，2015年，北京大学乔杰院士团队建立了基于NGS揭示等位基因突变的非整倍体测序与连锁分析方法（MARSALA），该方法对囊胚活检的细胞进行MALBAC全基因组扩增后，再通过PCR对目标基因的SNVs进行扩增富集，将两种扩增产物混合后进行低深度的NGS检测，可同时通过CNVs和SNVs分别检测非整倍体和单基因疾病，并进行了基于SNP的连锁分析，直接的突变位点检测避免了同源重组带来的误差。为确保结果的精准，研究者利用Sanger测序、aCGH、STR连锁分析对结果进行了进一步的验证，证实了MARSALA技术的可行性与检测精准程度。

高通量、低成本使NGS在临床各个领域如肿瘤学、生殖医学、微生物学等备受青睐，与目标序列捕获技术相融合的目标序列捕获测序，目前已成为PGT领先技术之一，但NGS需对DNA进行片段化处理，测序反应读长较短，需对数据进行大规模拼接，后期的数据分析仍是难点。在Haplarithmisis算法基础上，将PGT-M、PGT-A与PGT-SR一体化的OnePGT研究正在进行，利用第三代测序技术长读长的优势建立单倍型。这些如浪潮般更替的新兴技术，终将帮助人们克服各类技术瓶颈，逐步建立PGT的终极解决方案。